Estado actual de la Piscirickettsiosis en Salmones
Larenas, J.; Contreras, J. y Smith, P.
Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias
Santa Rosa 11.735, Santiago (Chile)

Financiado por Fondo Nacional de Investigación y Tecnología (FONDECYT) Nº 1960976, Chile

Infecciones rickettsiales en peces

   Aunque es conocida hace mucho tiempo la importancia y presencia de estos microorganismos en mamíferos, éstos sólo se han podido identificar y caracterizar en los últimos años en animales acuáticos. Los agentes rickettsiales en peces comenzaron a ser asociadas a enfermedades de importancia a desde fines de los años 80, fecha desde la cual han producido pérdidas económicas por altas mortalidades. En algunos casos se han aislado estos microorganismos tipo rickettsial, pero en otros sólo se han observado en frotis, cortes de tejido o por microscopía electrónica en diferentes regiones del mundo (Figura 1) sin poder llegar a ser caracterizados plenamente.

   El primer antecedente de la presencia de un microorganismo tipo rickettsia en peces, fue descrito por Mohamed en 1939 (Fryer y Mauel, 1997). Dicho reporte establece que en un pez enfermo de la especie Tetrodon fahaka proveniente del río Nilo en Egipto, se observaron dentro de monocitos y en el plasma, pequeñas formas cocoides que se teñían eosinofílicas con Giemsa. De acuerdo a las características observadas se pensó podía corresponder a una rickettsia, sin embargo, no se realizaron otros estudios para confirmar el tipo de agente (Fryer y Lannan, 1994).

Figura 1. Principales reportes de infecciones por agentes rickettsiales en peces en el mundo: Las fechas indican el año de la observación o aislamiento de la infección por rickettsia. En amarillo se muestra aquellas infecciones que han afectado a salmónidos. Cada color representa diferentes tipos de peces.

   En Alemania, en 1975, Özel y Schwanz-Pfitzner aislaron por primera vez un probable agente rickettsial desde un pez. El microorganismo fue obtenido de truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss) que demostraban signos de la enfermedad producida por el virus de Egtved (actualmente conocida como septicemia viral hemorrágica: VHS). Se utilizaron muestras de corazón, riñón, bazo y branquias de peces enfermos, que se cultivaron en la línea celular RTG-2 (derivada de gónadas de trucha arco iris) donde se produjo efecto citopático. Mediante microscopía electrónica se determinó que correspondía a algún agente del tipo rickettsia, sin embargo, no se preservó al microorganismo para futuros estudios. De acuerdo a lo anterior, no se le pudo caracterizar completamente ni determinar su potencial rol patógeno (Garcés y col, 1991).

   Posteriormente en Gran Bretaña, en las costas de Gales, Davies (1986) observó la presencia de RLO (Rickettsia Like Organism) en cortes histológicos y por microscopía electrónica de muestras de bazo de Callionymus lyra. La presencia del agente fue sólo un hallazgo casual, en un estudio que pretendía encontrar un parásito frecuente de la sangre denominado Haemogregarina quadrigemina.

   Entre 1988 y 1992 se presentaron brotes de baja mortalidad en salmón del Atlántico cultivados en la zona de la costa oeste de Noruega. Las lesiones macroscópicas e histopatológicas indicaban un gran compromiso hepático por lo que la enfermedad se denominó inicialmente "hepatitis necrotizante del salmón". De acuerdo a los estudios epidemiológicos y patológicos realizados por Olsen y col. (1997), se determinó que la enfermedad afectó sólo a "smolts" que habían sido transferidos recientemente al mar y que normalmente estaban en altas densidades y pobres condiciones nutricionales. Además, en muchos casos se reportó la enfermedad posterior a un "bloom" de algas. Las lesiones más comunes fueron focos necróticos en diferentes órganos, en especial en hígado y la presencia de un microorganismo cocoide dentro de diferentes células en vacuolas citoplasmáticas. En 1992, se logró aislar una rickettsia en cultivos celulares libres de antibióticos y que reaccionaba positivamente a anticuerpos anti-Piscirickettsia salmonis mediante inmunofluorescencia (Olsen y col. (1997).

   Piscirickettsia salmonis corresponde a la primera rickettsia aislada y caracterizada en peces. Esta bacteria fue aislada inicialmente en Chile en 1989 por Fryer y col. (1990) y Cvitanich y col. (1991), desde salmones de cultivo afectados por altas mortalidades. El agente corresponde a una nueva especie, que taxonómicamente está clasificada provisoriamente dentro de un nuevo género (Fryer y col., 1992). Produce lesiones necróticas en diversos órganos y afecta a diversas especies de salmónidos cultivados en Chile. La enfermedad que produce ha sido denominada de diversas formas tales como, "síndrome de Huito", "síndrome del salmón coho" (Bravo y Campos, 1989a y b), "síndrome rickettsial salmonídeo" (SRS) (Cvitanich y col., 1991) y "piscirickettsiosis" (Fryer y col., 1992).

   En 1995, Cvitanich y col. describieron un agente RLO, momentáneamente denominado U2, en salmones del Atlántico cultivados en el lago Llanquihue y en el mar (Décima Región de Chile), que se multiplica solamente en cultivos celulares. Las mortalidades que produce van de un 4 a 12% semanal en agua dulce manteniéndose así hasta unas seis semanas de transferidos al mar. La enfermedad corresponde a una septicemia que afecta principalmente a bazo y riñón y que cursa con anemia severa. El U2 es una bacteria Gram negativa, cocoide, inmóvil y de un tamaño variable que oscila entre 0,2 a 0,8 mm de diámetro. Este agente no ha sido caracterizado completamente hasta la fecha.

   En Canadá, a fines de 1991, la tasa de mortalidad aumentó de un 0,01% a 0,06% semanal, en salmones del Atlántico cultivados en la fase marina, en la costa oeste de British Columbia. Los signos más importantes fueron oscurecimiento, nado lento y anorexia. Las lesiones correspondieron a exoftalmia, estomatitis necrótica, úlceras dérmicas sobre el pedúnculo caudal, petequias en la serosa, espleno y hepatomegalia, y focos blanquecinos y fibrosis en hígado. Histopatológicamente hubo necrosis en diversos órganos e inflamación. Vasculitis y trombosis también fueron observadas. Dentro de macrófagos se encontraron microorganismos basofílicos, Gram negativos, Giemsa positivos, Macchiavello negativos y se teñían azul con azul de toluidina. Los signos y lesiones postmortem fueron concordantes con los encontrados con piscirickettsiosis en Chile (Brocklebank, y col., 1992 a y b). Una condición similar, probablemente idéntica, se presentó en 1970 y 1978 en salmón rosado silvestre (O. gorbuscha) cultivados en tanques con agua de mar con propósitos experimentales (Kent, 1992). Otro cuadro de semejantes características se presentó en 1980, en coho y chinook. (Brocklebank, y col., 1992 a y b). En ninguno de los casos mencionados se intentó el aislamiento del agente. Recientemente, Jones y col. (1997 y 1998) aislaron un agente similar a P. salmonis desde salmones del Atlántico cultivados en la costa este de Cánada, sugiriendo que correspondería a una cepa de esta bacteria.

   Una enfermedad similar a la descrita en Canadá, se presentó en 1991 en el Oeste de Irlanda. Al igual que la anterior, afectó a "postsmolts" de salmón del Atlántico, siendo las lesiones macro y microscópicas muy similares a las descritas para la piscirickettsiosis. Aunque no se aisló ningún agente causal, en la mayoría de los tejidos, fue observado un microorganismo similar a P. salmonis. Las bajas mortalidades que se presentaron fueron atribuidas a las bajas densidades poblacionales en cultivo (Rodger y Drinan, 1993). Entre 1995 - 1996 se produjeron nuevamente cuatro brotes de mortalidad en Irlanda del Norte, lográndose aislar en esa oportunidad un agente rickettsial en cultivo celular de la línea CHSE-214, que reaccionó positivamente a anticuerpos anti P. salmonis. La etiología de la enfermedad fue confirmada mediante inoculación experimental (Palmer y col., 1997).

   Grant y col. (1996) reportaron el aislamiento de un microorganismo RLO en Escocia que produjo altas mortalidades en salmón del Atlántico, a fines de 1995. Los signos clínicos se caracterizaron por nado anormal y a la necropsia solamente se evidenció esplenomegalia. La lesión histopatológica más característica fue encefalitis asociada a vasculitis, encontrándose gran cantidad de un microorganismo cocoide, basofílico y de aproximadamente 1 mm de diámetro. El agente fue aislado desde cerebro en la línea celular CHSE-214 sin antibiótico, donde produjo un efecto citopático a los nueve días de incubación a 15ºC. El RLO fue sensible a oxitetraciclina y ácido oxolínico. La enfermedad pudo ser reproducida en forma experimental completándose los postulados de Koch.

   Recientemente Chen y col. (1994), describieron la primera enfermedad producida por un RLO en tilapia (Tilapia nilotica). La afección se produjo entre 1992 y 1993, provocando una tasa de mortalidad que en promedio fue de 30% y cuyo máximo alcanzó un 75% en algunas piscifactorías. Las lesiones principales se caracterizaron por necrosis, vasculitis, trombosis, inflamación crónica y presencia de nódulos blanquecinos en diversos órganos. En todos los tejidos analizados se observó la presencia de un microorganismo tipo rickettsia dentro de vacuolas intracitoplasmáticas. Este agente fue aislado a partir de muestras de bazo en la línea celular CHSE-214, sin embargo, en ésta no produjo efecto citopático. La enfermedad fue reproducida mediante la inoculación experimental de tejido esplénico proveniente de peces naturalmente infectados. Una enfermedad de características similares ha sido descrita hace poco en Japón (Wada y col., 1995).

   Khoo y col. (1995) detectaron la presencia de RLO en dos peces tropicales de agua dulce (Panaque suttoni), enviados desde Colombia a Estados Unidos. El hallazgo se efectuó mediante exámenes citológicos, histopatológicos y microscopía electrónica de transmisión. Las lesiones macroscópicas fueron reno y esplenomegalia. El organismo se detectó dentro de vacuolas citoplasmáticas de monocitos y macrófagos de bazo, corazón riñón e hígado.

   En el mediterráneo de Francia, Comps y col. (1995), encontraron RLO en el cerebro de "Sea bass" juveniles (Dicentrarchus labrax), los cuales presentaban comportamientos de nado anormal.

   La denominada intoxicación o enfermedad por salmón, es una afección rickettsial que afecta a perros y zorros, siendo transmitida mediante un tremátodo que actúa de vector, constituyéndose el salmón sólo como un huésped intermediario. La asociación entre la muerte de los perros y el parásito fue descubierta en los inicios del siglo XIX en Norte América, cuando se observó que los perros que eran alimentados con salmón crudo morían frecuentemente. El agente etiológico es Neorickettsia helmintheca que se encuentra en metacercarias de la tenia Nanophyetus salmincola. El ciclo del parásito requiere además del caracol de la especie Oxytrema silicula (Fig. 2), que se encuentra sólo en la región noroeste del Pacífico de Estados Unidos y en la costa este de Siberia (Georgi y Georgi, 1994).

Figura 2. Ciclo vital del parásito tremátodo Nanophyetus salmincola: Todos los estados del parásito pueden ser vectores de Neorickettsia helminthoeca.

   El ciclo de vida de N. salmincola se ilustra en la figura número 2. Los huevos eliminados en las heces dan origen a embriones que eclosionan (miracidios) después de un largo período de incubación (87-200 días). Luego, parasitan al caracol (estado de redia) que habita ríos correntosos. Hasta la fecha no se ha demostrado la formación de esporoquistes. Posteriormente cercarias invaden a los peces, especialmente salmónidos (también afecta peces no salmónidos y a la salamandra del Pacífico), a través de la piel y las branquias, formando el estado de metacercaria. Estas se encuentran diseminadas por todo el cuerpo del pez, pero se concentran especialmente en riñón, músculos y aletas. En general esta parasitosis no produce signos clínicos en los perros, sin embargo, este parásito puede transportar a la bacteria denominada Neorickettsia helminthoeca, la cual produce severas alteraciones gastroentéricas y en muchos casos la muerte. Se cree que el verdadero huésped definitivo para el parásito son el mapache y el zorrillo. Estos animales, así como el hombre parecen ser inmunes a la infección por la rickettsia aunque pueden ser afectados eventualmente por el parásito (Georgi y Georgi, 1994).

 

Piscirickettsiosis

Historia natural de la enfermedad

   Los primeros brotes de la enfermedad se presentaron a fines del año 1989, aunque se ha sugerido que ésta estaría presente al menos desde 1981 (Bravo y Campos, 1989a). Inicialmente fue descrita sólo en salmón coho (Síndrome del salmón coho), pero pronto fueron afectadas todas las especies de salmónidos cultivadas en Chile, llegando a producir hasta un 90% de mortalidad en algunos centros (Bravo y Campos, 1989a y 1989b; Cvitanich y col. 1990; Alvarado y col., 1990; Fryer y col., 1990; Branson y Nieto Díaz-Muñoz, 1991; Cvitanich y col., 1991). Los cálculos iniciales establecieron una mortalidad de 1,5 millones de salmones coho, lo que representó una pérdida estimada de 10 millones de dólares para el año 1989 (Cvitanich y col., 1990).

   La enfermedad ha sido descrita principalmente en agua de mar y estuarina (Bravo y Campos, 1989a y 1989b; Fryer y col., 1990; Branson y Nieto, 1991; Cvitanich y col., 1991) y muy ocasionalmente en agua dulce (Bravo, 1994; Gaggero y col., 1995). Los primeros brotes se relacionaron a un período posterior a fluctuaciones en la temperatura del agua, presencia de un "bloom" de algas no-tóxicas y/o estrés relacionado a severas tormentas (Branson y Nieto Díaz-Muñoz, 1990). Las epizootias se presentan especialmente entre otoño y primavera (Bravo y Campos, 1989a, Alvarado y col., 1990; Cvitanich y col., 1991) cuando las temperaturas oscilan entre 9 - 16ºC (Lannan y Fryer, 1994). Recientemente, se ha propuesto que el proceso de esmoltificación puede incrementar la susceptibilidad de los salmones infectados (Graumann y col., 1997).

   Es necesario recordar que en un inicio debido a la aparente especificidad de la infección por el salmón coho, la tendencia fue por un lado disminuir las densidades y por otro aumentar la producción de salmón del Atlántico y trucha arco iris. Frente a esa nueva situación la enfermedad comenzó a diagnosticarse de forma creciente en estas especies (Alvarado y col., 1990).


Signos clínicos y lesiones

   Los signos clínicos se caracterizan por un nado en la superficie, lento, errático y a veces en tirabuzón. Además se ha descrito letargia, anorexia, choque contra las paredes de la balsa jaula, orillamiento y oscurecimiento. Las lesiones macroscópicas externas (Fotografía 1), más relevantes, incluyen: descamación, palidez branquial, hemorragias equimóticas y petequiales en la base de las aletas, nódulos y úlceras en la piel de hasta 2 cm de diámetro (Bravo y Campos, 1989a y b; Cubillos y col., 1990; Cvitanich y col., 1990; Schäfer y col., 1990; Branson y Nieto Díaz-muñoz, 1991; Cvitanich y col., 1991; Larenas y col., 1995). Los niveles de hematocrito reflejan una severa anemia (Bravo y Campos, 1989a y 1989b; Branson y Nieto Díaz-Muñoz, 1991).

Fotografía 1. Lesiones producidas por Piscirickettsia salmonis: Salmón del Atlántico infectado naturalmente con P. salmonis. Se puede observar hemorragias en la base de las aletas (a) y en el tejido muscular (b) de la pared abdominal. Además se aprecia el hígado de aspecto moteado (c) y esplenomegalia (d).

   En el análisis de necropsia de la cavidad abdominal, es frecuente encontrar la presencia de ascitis, reno y esplenomegalia, nodulaciones subcapsulares de color cremoso a amarillento en el hígado, presencia de una pseudomembrana sobre el corazón y hemorragias petequiales en estómago, ciegos pilóricos, intestino, vejiga natatoria, muscular y grasa viceral (Schäfer y col., 1990; Branson y Nieto Díaz-Muñoz, 1991; Cvitanich y col., 1991; Larenas y col., 1995). En la mayoría de los casos el intestino está lleno con un contenido mucoso amarillento y el estómago con un líquido transparente seromucoso (Schäfer y col., 1990); esto último da la impresión de que el pez haya tragado agua (Alvarado y col., 1990).

   Desde el punto de vista histopatológico las lesiones principales corresponden a necrosis en diversos órganos y tejidos, siendo los más afectados el riñón, hígado, bazo e intestino (Fotografías 2, 3 y 4). También es común observar lesiones vasculares semejantes a las descritas para rickettsias en mamíferos, tales como necrosis endotelial y formación de trombos. Además se puede encontrar macrófagos conteniendo organismos dentro del citoplasma, coagulación intravascular, inflamación perivascular, pericarditis, endocarditis, lesión inflamatoria crónica en la lámina propia del intestino, incremento del número de células granulares del estrato granuloso intestinal e hiperplasia y fusión laminillar (Cubillos y col., 1990; Cvitanich y col., 1991; Branson y Nieto Díaz-Muñoz, 1991; Larenas y col, 1995).

Fotografía 2. Lesiones histopatológicas producidas por Piscirickettsia salmonis: Hígado. Salmón coho experimentalmente infectado con P. salmonis. Se observa necrosis (a) y el agente rickettsial con aspecto morular dentro de una gran vacuola citoplasmática (b). Giemsa. 400X.

Fotografía 3. Riñón anterior. Presencia de P. salmonis en el interior del citoplasma de una célula endotelial. Tejido proveniente de salmón coho inoculado intraperitonealmente. Giemsa. 1000X.

Fotografía 4. Severo daño endotelial y formación de un trombo. Salmón coho inoculado experimentalmente vía intraperitoneal. H/E. 400X.

Características del agente etiológico

   Piscirickettsia salmonis es un agente patógeno intracelular obligado, que se multiplica por división binaria. Es citopático para diferentes líneas celulares de salmónidos y de algunas de peces de aguas cálidas (Tabla 1), produciendo inicialmente la formación de agrupaciones de células redondeadas y vacuoladas y finalmente la lisis con desprendimiento de la monocapa (Fryer y col., 1990) (Fotografía 5). Su temperatura óptima de crecimiento se encuentra dentro del intervalo de 15 a 18ºC, disminuyendo marcadamente su replicación bajo 10ºC y sobre 21ºC. Para su conservación a -70ºC se recomienda el uso de DMSO como criopreservante (Fryer y col., 1990).

Fotografía 5. Cultivo celular (CHSE-214) infectado con P. salmonis: Las células del cultivo presentan vacuolas citoplasmáticas en cuyo interior se observa la presencia de microorganismos cocoides correspondientes a P. salmonis. 1000X.

   El microorganismo es Gram negativo, inmóvil, no encapsulado, pleomórfico, habitualmente cocoide, en pares o en forma de anillo y de un tamaño variable entre 0.5-1.5 mm de diámetro (Fryer y col., 1990; Cvitanich y col., 1991). En frotis de sangre y tejidos las rickettsias se tiñen con hematoxilina-eosina (HE), Giemsa y azul de metileno (Bravo y Campos, 1989; Cvitanich y col., 1990), observándose dentro de vacuolas citoplasmáticas rodeadas por una membrana (Fryer y col., 1990; Cvitanich y col., 1991; Almendras y col., 1997b), en forma esparcida o agrupaciones que le dan un aspecto de mórula (Cvitanich y col., 1991). Mediante microscopía electrónica se ha observado que el agente posee en su superficie dos membranas, una externa ondulada y una interna citoplasmática, que es característico de agentes rickettsiales (Fryer y col., 1990). Posee además estructuras similares a ribosomas cerca de la membrana plasmática, un ADN fibrilar en la región central y estructuras esféricas electro densas (Fryer y col., 1990; Cvitanich y col., 1991) (Fotografía 6).

Fotografía 6. P. salmonis observada mediante microscopio de transmisión: Piscirickettsia salmonis en un corte para microscopía electrónica. El microorganismo se observa dentro de una vacuola. Nótese la membrana externa ondulada.

   De acuerdo a los trabajos realizados por Kuzyk y col. (1996), existen seis antígenos principales en la bacteria. Una molécula de 11 kDa, que representa probablemente un oligosacárido (LOS) componente del lipopolisacárido (LPS) que es parte de la membrana externa de las rickettsias y gramnegativos. Posee además un LOS de 16 kDa, que formaría parte del "core" y cuatro proteínas de un tamaño molecular de 65, 60, 54 y 51 kDa. Recientemente Barnes y col. (1998), han obtenido resultados diferentes a los autores anteriores, lo que se ha explicado por la metodología de purificación del agente y el uso de un distinto antisuero anti P. salmonis de conejo. En este último trabajo se establecieron ocho proteínas antigénicas probablemente propias de P. salmonis (108, 95, 60, 56, 40, 36, 32 y 20 kDa), de las cuales sólo tres tienen pesos moleculares similares a los resultados de los investigadores anteriores. Los principales antígenos estarían dados por pesos moleculares de 56, 36 y 20 kDa.

Tabla 1. Líneas celulares que permiten la multiplicación de Piscirickettsia salmonis.

Línea celular Especie de origen Cepa u origen de P. salmonis Referencia
CHSE-214 Oncorhynchus tshawytscha LF-89, Salmón Coho (Chile) Fryer y col., 1990
Salmón coho (Chile) Cvitanich y col., 1991
CSE-119 Oncorhynchus kisutch LF-89, Salmón Coho (Chile) Fryer y col., 1990
Salmón coho (Chile) Cvitanich y col., 1991
CHH-1 Oncorhynchus keta LF-89, Salmón Coho (Chile) Fryer y col., 1990
Salmón coho (Chile) Cvitanich y col., 1991
RTG-2 Oncorhynchus mykiss LF-89, Salmón Coho (Chile) Fryer y col., 1990
Salmón coho (Chile) Cvitanich y col., 1991
EPC Cyprinus carpio LF-89, Salmón Coho (Chile) Fryer y col., 1990
Salmón coho (Chile) Cvitanich y col., 1991
FHM Pimephales promela LF-89, Salmón Coho (Chile) Fryer y col., 1990
Salmón coho (Chile) Cvitanich y col., 1991
BF-2 Ictalurus nebulosus LF-89, Salmón Cohoa (Chile) Almendras y col., 1997b
a El comienzo del efecto citopático es tardío (45 días postinoculación)

Sensibilidad frente a antibióticos

   De acuerdo a los estudios de Fryer y col. (1990), la cepa de P. salmonis aislada (LF-89) a partir de los primeros brotes de la enfermedad, demostraron una sensibilidad frente a numerosos antibióticos, siendo sólo resistente a penicilina. Además, Cvitanich y col. (1991) observaron que los siguientes compuestos inhibían el crecimiento de la bacteria en cultivos celulares: Claritromicina, cloramfenicol, eritromicina, gentamicina, oxitetraciclina y sarafloxacina (Fryer y col., 1990; Cvitanich y col., 1991). Sin embargo, estudios relativamente recientes, han sugerido una posible generación de resistencia frente a diferentes quimioterápicos utilizados para el tratamiento de la piscirickettsiosis (Tabla 2). Al respecto, la cepa SLGO-95, presenta resistencia a todos los antibióticos estudiados, atribuido al uso excesivo de estas drogas por varios años (Smith y col., 1996b). Pocas son las investigaciones realizadas en aislamientos de otros países. El único estudio publicado de Palmer y col. (1997), ha evidenciado resistencia de un aislamiento de Irlanda del Norte, frente a cotrimoxasol, furazolidona y penicilina y sensibilidad a ácido oxolínico (Tabla 2).

   Recientemente, Arriagada y col. (1996), han determinado que la citometría de flujo puede ser un método altamente sensible para determinar concentraciones mínimas inhibitorias (CIM) de antibióticos para P. salmonis, ya que proporciona el estado de infección de cada célula analizada, siendo posible obtener los resultados en un menor tiempo.


Procedimientos de diagnóstico

   La inoculación de líneas celulares con tejido renal, proveniente de peces infectados, es el método más concluyente para la detección de P. salmonis (Fryer y col., 1990; Cvitanich y col., 1991; OIE, 1997), sin embargo, constituye un problema el hecho de que éstos deben ser usados sin antibióticos, debido a la sensibilidad de la rickettsia frente a ellos (Fryer y Mauel, 1997).

   Los métodos recomendados de tinción de frotis y tejidos son Gram, Giemsa, naranja de acridina (Fryer y col., 1990; Cvitanich y col., 1991; Lannan y Fryer, 1991; Lannan y Fryer, 1993; OIE, 1997) y/o azul de toluidina (Larenas y col., 1995). Estas técnicas son adecuadas para la identificación inicial de rutina. El método de inmunofluorescencia indirecta, desarrollado por Lannan y col. (1991), es en la actualidad uno de los métodos más sensible y específico para el diagnóstico de la piscirickettsiosis. Esta técnica ha sido modificada mediante el uso de microondas (Larenas y col., 1996a), disminuyendo marcadamente los tiempos de incubación del primer y segundo anticuerpo, sin variar la especificidad y sensibilidad.

   Recientemente se han desarrollado dos técnicas de ELISA por laboratorios comerciales (RelisaTM-SRS, Microtek International Ltd. Canadá. y RicK-DtextTM, DiagXotics, Inc. USA ) para el diagnóstico de P. salmonis a partir de muestras renales.

   El reciente desarrollo de una técnica de PCR ("Polymerase Chain Reaction") abre nuevas expectativas en el diagnóstico de la piscirickettsiosis. Al respecto, Mauel y col. (1996) han desarrollado cuatro "primers" (PS2S, PS2AS, PS3AS y EM90AS) que permiten diferenciar P. salmonis de otras bacterias, así como la diferenciación de la cepa EM-90 con la de referencia, LF-89. Esta prueba es altamente sensible y específica, pudiendo detectar hasta 1 Dosis Infectante de Cultivo de Tejido 50% (TCID50).


Tabla 2. Sensibilidad de aislados de P. salmonis frente a diferentes antibióticos.

Antibiótico Referencia
Inhibición del crecimiento
Cepa y/u origen
Concentración (CMI)
Referencia
Ac. Oxolínico
No
SLGO-94 1 mg/mLa Smith y col., 1996b
No
LF-89 2,5 mg/mLa Smith y col., 1996b
No
SLGO-95 3 mg/mLa Smith y col., 1996b
Si
EM-90 0,5 mg/mLa Smith y col., 1996b
Si
Irlanda 1 mg/mL Palmer y col., 1997
Claritromicina
Si
Chile 1 mg/mLa Cvitanich y col., 1991
Cloramfenicol
No
SLGO-95 20 mg/mLa Smith y col., 1996b
Si
LF-89 0,5 mg/mLa Smith y col., 1996b
Si
EM-90 1 mg/mLa Smith y col., 1996b
Si
Chile 4 mg/mLa Cvitanich y col., 1991
Si
SLGO-94 5 mg/mLa Smith y col., 1996b
Cotrimoxasol
No
Irlanda 40 mg/mL Palmer y col., 1997
Eritromicina
Si
Chile 10 mg/mLa Cvitanich y col., 1991
Espectinomicina
No
Chile > 100 mg/mLa Cvitanich y col., 1991
Estreptomicina
Si
LF-89 100 mg/mL Fryer y col., 1990
Flumequina
No
SLGO-94 >100 mg/mLa Smith y col., 1996b
No
SLGO-95 10 mg/mLa Smith y col., 1996b
No
EM-90 2,5 mg/mLa Smith y col., 1996b
Si
LF-89 0,1 mg/mL a Smith y col., 1996b
Furazolidona
No
Irlanda 50 mg/mL Palmer y col., 1997
Gentamicina
No
SLGO-94 25 mg/mLa Smith y col., 1996b
No
LF-89 38 mg/mLa Smith y col., 1996b
No
EM-90 50 mg/mLa Smith y col., 1996b
No
SLGO-95 50 mg/mLa Smith y col., 1996b
Si
LF-89 50 mg/mL Fryer y col., 1990
Oxitetraciclina
No
SLGO-95 3 mg/mLa Smith y col., 1996b
Si
EM-90 0,5 mg/mLa Smith y col., 1996b
Si
Irlanda 1 mg/mL Palmer y col., 1997
Si
Chile 1 mg/mLa Cvitanich y col., 1991
Si
SLGO-94 1 mg/mLa Smith y col., 1996b
Si
LF-89 2,5 mg/mLa Smith y col., 1996b
Penicilina
No
Chile >100 UI/mLa Cvitanich y col., 1991
No
LF-89 100 UI/mL Fryer y col., 1990
No
Irlanda 100 UI/mL Palmer y col., 1997
Sarafloxacina
Si
Chile 0,1 mg/mLa Cvitanich y col., 1991
Tetraciclina
Si
Chile 1 mg/mLa Cvitanich y col., 1991
Si
LF-89 15 mg/mL Fryer y col., 1990
a Valores de CMI


Diseminación de la infección

Transmisión horizontal

   De acuerdo a los reportes tanto en condiciones naturales como experimentales, se ha establecido que todas las especies de salmónidos cultivadas en Chile son susceptibles de ser afectadas por la enfermedad (Bravo y Campos, 1989a y b; Alvarado y col., 1990; Branson y Nieto Díaz-Muñoz, 1990; Cvitanich y col. 1990; Fryer y col., 1990; Cvitanich y col., 1991; Fryer y Mauel, 1997). Sin embargo, no existen suficientes estudios que hayan determinado las diferencias en susceptibilidad entre las especies salmonídeas. Al respecto, Smith y col. (1996a) han demostrado experimentalmente una mayor resistencia a la infección en truchas arco iris en relación a salmón coho, estableciendo para este último el DL50 (Dosis letal 50%) y la DI50 (Dosis infectante 50%) (Tabla 3).

Tabla 3. Dosis letal 50% (DL50) y dosis infectante 50% (DI50) en salmón coho y trucha arco iris inoculadas vía intraperitoneal (Smith y col., 1996a).

Especie
DL50 (TCID50/mL)
DI50 (TCID50/mL)
Salmón coho
102,8
101,9
Trucha arco iris
No determinada
102,4

   Las experiencias realizadas por Cvitanich y col. (1991), Almendras y col. (1997a) y Salinas y col. (1997), han demostrado transmisión horizontal en condiciones de agua dulce, la cual se ve favorecida por el contacto entre los peces (Almendras y col., 1997a) y al aumentar la densidad poblacional (Salinas y col. 1997). La infección se produce a pesar de que se ha demostrado in vitro una baja viabilidad de P. salmonis en agua dulce (Lannan y Fryer, 1994). Experimentalmente, se ha observado que el agente es eliminado mediante las heces, orina y bilis, que podrían constituir las posibles vías de infección (Salinas y col., 1997) (Figura 3).

   De acuerdo a Salinas y col. (1997), la transmisión horizontal en condiciones de agua dulce, depende directamente de la densidad poblacional. En sus investigaciones lograron mortalidades acumuladas de un 4% con una densidad de 20 kg/m3 y 14% con 40 kg/m3, en truchas arco iris mantenidas en cohabitación con inoculadas con P. salmonis vía intraperitoneal (IP). Estos resultados contrastan con los obtenidos por Almendras y col. (1997a), que obtuvieron mortalidades superiores al 50% en Salmón del Atlántico a 27 kg/m3, sin embargo en este último caso, un 76% de los peces estaban infectados de forma concomitante con Aeromonas salmonicida. De acuerdo con estos resultados, la infección horizontal se favorece al aumentar el contacto entre los peces (Almendras y col., 1997a). Al respecto, Garcés y col. (1991), no lograron demostrar este tipo de transmisión en salmones coho mantenidos en cohabitación con inoculados, lo que probablemente se debió a la baja densidad poblacional con que se trabajó (3 kg/m3).

   La enfermedad natural se presenta generalmente 6 a 12 semanas del ingreso de los "smolts" al mar (Alvarado y col., 1990; Cvitanich y col., 1991). Fryer y col. (1990), han postulado la posible presencia de vectores marinos que mantendrían al agente. Esta hipótesis ha sido reafirmada por Garcés y col. (1991) que han demostrado experimentalmente que los peces también son susceptibles en condiciones de agua dulce, lo que asociado al hecho de la escasa presentación natural de la enfermedad en esas condiciones, hacen suponer que la fuente se encuentra en el mar. Los resultados de Garcés y col. (1994), Venegas (1995) y Correal (1996), han demostrado la presencia de P. salmonis, mediante inmunofluorescencia, en el parásito hematófago denominado Ceratothoa gaudichaudii y en el ectoparásito Caligus sp. (Tabla 4) lo cual indica que pueden ser vectores o reservorios marinos del agente.

   Se ha sugerido la posible participación de especies acuáticas como fuentes o reservorios de la enfermedad (Tabla 4). Mediante anticuerpos policlonales anti-P. salmonis, utilizando la técnica de inmunofluorescencia indirecta, se ha detectado positividad en cabrilla, jurel, choritos, picorocos, copépodos de vida libre y poliquetos, sin embargo, la participación que puedan cumplir estas especies no ha sido dilucidada (Venegas, 1995; Correal, 1996) (Tabla 4).

   Recientemente, Smith y col. (1998) han demostrado en forma experimental que P. salmonis puede penetrar por piel y branquias sin lesiones en ausencia de vectores. Además estos investigadores establecieron que la inoculación subcutánea del agente patógeno es capaz de producir altas mortalidades, lo cual sugiere que los ectoparásitos pudieran jugar un papel en la transmisión horizontal de la enfermedad.

   De acuerdo a los antecedentes anteriores, se puede colegir que probablemente P. salmonis es eliminado en las heces y orina de peces infectados, especialmente de aquellos que presentan signos y síntomas de piscirickettsiosis; luego es capaz de infectar peces vía branquial y/o por la piel intacta. Las condiciones de supervivencia en agua salada, la presencia de ectoparásitos como Caligus sp. y Ceratothoa gaudichaudii o lesiones traumáticas de la piel, probablemente favorecen la diseminación de la infección. Los antecedentes hasta la fecha disponibles no permiten establecer la importancia de reservorios o vectores marinos (Fig. 3).


Tabla 4. Positividad a P. salmonis mediante inmunofluorescencia indirecta en peces, moluscos, parásitos y copépodos de vida libre asociados a jaulas de cultivo de salmónidos infectados en forma natural en condiciones de agua de mar.

Nombre común
Nombre científico
Número muestreado
Positivos
%
Período
Referencia
Peces 
Cabrilla Paralabrax humeralis
4
1
25
Inv-Prim
Venegas, 1996
Jurel Trachurus murphyi
58
5b
8,6
Verano
Correal, 1995
50
1
2
Inv-Prim
Venegas, 1996
Pejerrey Basilichthys australis
52
0
0
Verano
Correal, 1995
Róbalo Eliginops maclovinus
2
0
0
Inv-Prim
Venegas, 1996
10
0
0
Verano
Correal, 1995
Merluza Merluccius sp.
9
0
0
Inv-Prim
Venegas, 1996
Moluscos 
Chorito

Mytilus chilensis

 

120
5
4,2
Verano
Correal, 1995
195
0
0
Inv-Prim
Venegas, 1996
Crustáceos 
Picorocos Balanus psittacus
120
0
0
Verano
Correal, 1995
188
10
5,3
Inv-Prim
Venegas, 1996
Copépodos de vida libre No determinado. Diversas especies
62
16
25,8
Verano
Correal, 1995
187
17
9,1
Inv-Prim
Venegas, 1996
Ectoparásitos 
Ceratotoa Ceratothoa gaudichaudii
60
6
10
Verano
Correal, 1995
222
7
3,2
Inv-Prim
Venegas, 1996
Caligus Caligus sp.
72a
2b
2,8
Verano
Venegas, 1996
189
13
6,9
Inv-Prim
Correal, 1995
Anélidos
Poliquetos No determinado. Diversas especies
72
2
2,8
Verano
Correal, 1995
aTotal de frotis obtenidos
b Muestras sospechosas

Transmisión vertical

   Los primeros antecedentes que sugirieron la existencia de transmisión vertical fueron entregados por Bustos y col. (1994), sin embargo, los resultados obtenidos por dicha investigación no fueron concluyentes, debido principalmente a que los grupos controles negativo también aparecieron infectados con P. salmonis. En forma experimental, Larenas y col. (1996b) han logrado la infección vertical de ovas al estado de ojo, provenientes de reproductores machos y/o hembras inoculados IP con el agente rickettsial. El agente fue demostrado tanto en fluido seminal y ovárico, así como en el interior de espermios y ovas no fertilizadas. Estos resultados sin embargo pueden no estar reflejando las condiciones de infección natural. En un trabajo reciente, no publicado, hemos determinado la existencia de transmisión vertical en salmones coho naturalmente infectados lo que corrobora los resultados experimentales.

Figura 3. Transmisión de Piscirickettsia salmonis: Vías de excreción y posibles vías de transmisión de piscirickettsiosis.


Medidas de Prevención

   Hasta la fecha los intentos para evitar los brotes de la enfermedad han sido infructuosos y no se la ha podido erradicar de zonas endémicas. Para reducir las pérdidas, en general los centros de cultivo han disminuido las densidades poblacionales por jaula, de acuerdo a observaciones empíricas pero no adecuadamente comprobadas. Esta medida fue recomendada en los inicios de los primeros brotes de la enfermedad por Bravo y Campos (1989), quienes además recomendaron disminuir las medidas de manejo para evitar el estrés en los peces.

   Los resultados de las terapias con antibióticos vía oral o inyectable han sido inconsistentes y en general no han sido capaces de controlar la enfermedad de forma efectiva. Esto además ha estado correlacionado al posible hecho de la aparición de resistencia en algunas cepas (Smith y col., 1996b), variabilidad en los tiempos y dosis de aplicación de las drogas y el uso cada vez mayor de nuevas alternativas de tratamiento.

   Los resultados de Salinas y col. (1997) han demostrado la excreción de P. salmonis en heces, orina y bilis de peces experimentalmente infectados. La eliminación del agente por estas vías, tiende a aumentar en los peces que se encuentran moribundos. Estos estudios, asociados al hecho de que la supervivencia del agente en agua salada es alta (Lannan y Fryer, 1994), hacen aconsejable la pronta extracción de los peces enfermos y muertos de las balsas afectadas. Lo anterior está asociado además a la posibilidad de entrada del agente por la vía branquial y cutánea intacta (Pérez, 1997; Smith y col., 1998).

   La posible elaboración de una vacuna aparece hoy en día como una posible estrategia para controlar la enfermedad (Smith y col., 1995), sin embargo, faltan mayores investigaciones en relación a la respuesta inmunoprotectiva que ellas pueden generar (Smith y col., 1997). Smith y col. (1995) han tenido aparentemente buen éxito con una vacuna formalinizada de P. salmonis (cepa LF-89) en condiciones de campo. Paradójicamente, los resultados indicaron que el uso de una mayor concentración de antígeno con adyuvante de Freund no favoreció una respuesta protectora (Gráfico 1).

   En condiciones experimentales se ha observado una disminución de las mortalidades en peces vacunados con una bacterina preparada con la cepa LF-89, comparado con peces inoculados IP. Estos resultados sugieren que existe una respuesta inmunoprotectiva, sin embargo, las variaciones genéticas y antigénicas de P. salmonis deben ser consideradas en las estrategias futuras para el desarrollo de vacunas (Smith y col., 1997).

   Recientemente, mediante radioinmunoensayo (RIA) se ha determinado una elevación, aunque moderada, de los niveles de anticuerpos circulantes en peces vacunados, desafiados en forma experimental, así como en peces naturalmente infectados (Smith y col., 1997).

   En la actualidad existen dos vacunas inactivadas de P. salmonis (Ricketvac Aqua®, Laboratorios Recalcine, Santiago, Chile. Aqua Vac-SRS®, Aquaculture S.A. Services and Research, Santiago, Chile), disponibles comercialmente en Chile, sin embargo, sus efectividades no han sido suficientemente documentadas en condiciones experimentales y de campo. De acuerdo a los fabricantes estás pueden conferir un índice de protección de hasta un 71%.

Gráfico 1. Mortalidad acumulada (%) en salmones coho (Oncorhynchus kisutch) vacunados con bacterinas de P. salmonis y desafiados en condiciones de campo (Smith y col., 1995).


Referencias Bibliográficas



Artículo publicado en la Revista AquaTIC nº 5, noviembre 1998