Caracterización de los mecanismos moleculares y neuroendocrinos mediados por las kisspeptinas en el cerebro de machos de lubina europea (Dicentrarchus labrax) y relacionados con la pubertad y fertilidad

Resumen

El conocimiento del proceso reproductor en peces teleósteos, así como su control endocrino, constituye un aspecto crítico para la industria acuícola ya que la actividad comercial de dicha industria no se sostendría sin la capacidad de producir en cautividad una descendencia de calidad y con las características adecuadas para el cultivo intensivo. Sin embargo, muchas especies de teleósteos mantenidas en sistemas de cultivo artificial sufren importantes disfunciones reproductivas de índole endocrina. Estudios realizados en humanos y ratas sugirieron que la kisspeptina, un neuropéptido que se expresa en el cerebro, juega un papel muy importante en el control de la función reproductiva de los mamíferos. Sin embargo, en peces teleósteos existían hasta la fecha pocos estudios sobre este sistema, lo que invitaba a realizar un estudio profundo del papel funcional del sistema Kisspeptina en la reproducción de peces teleósteos, cuyos resultados pudieran emplearse para mejorar el control del proceso reproductivo (ciclo reproductor y/o pubertad) en la acuicultura. Por ello, el objetivo general de esta Tesis Doctoral fue ampliar el conocimiento acerca del sistema Kiss/Gpr54 y su función en la reproducción de peces teleósteos, tomando como modelo de estudio la lubina europea (Dicentrarchus labrax).

Los primeros estudios del sistema kisspeptina realizados en mamíferos, concretamente en humanos y en ratones revelaron que ciertas mutaciones que inactivaban al receptor de la kisspeptina, denominado GPR54, daban lugar al desarrollo de hipogonadismo hipogonadotrópico. Este hecho sugirió que el sistema KISS1/GPR54 juega un papel importante en la función reproductiva de los mamíferos. En los mamíferos placentarios hay un solo gen KISS1 y otro que codifica GPR54. Sin embargo, en diferentes especies de teleósteos se ha descrito un segundo parálogo ancestral tanto de kiss1 como de gpr54-1b, denominados kiss2 y gpr54-2b, respectivamente. Por tanto, es de esperar que la duplicidad de este sistema en peces, es decir, dos formas de kisspeptina y dos formas de Gpr54, pudiera dar lugar a una interacción diferencial entre ligandos y receptores. Es por ello que el primer objetivo específico de esta Tesis fue analizar la funcionalidad y especificidad de los ligandos del sistema Kiss/Gpr54. Los resultados obtenidos muestran que los receptores de kisspeptinas de lubina poseen selectividad diferencial por el ligando. Así, el receptor Gpr54-1b se activa preferentemente por los péptidos derivados de Kiss1, mientras que el receptor Gpr54- 2b presenta una unión preferencial por los péptidos derivados de Kiss2, aunque también se activa en presencia de los péptidos derivados de Kiss1. Estos datos, junto a aquellos disponibles en otras especies, ponen en evidencia que en los teleósteos existen diferentes niveles de activación para los pares Kiss/Gpr54.

Estudios previos a la realización de esta Tesis Doctoral habían analizado los efectos en peces de kisspeptinas exógenas administradas de manera periférica. Este tipo de administración de los péptidos puede enmascarar la señalización real de la kisspeptina en el cerebro, ya que la kisspeptina circulante en el torrente sanguíneo podría actuar a otros niveles del eje reproductivo como la hipófisis o las gónadas, y podría resultar inaccesible para áreas concretas del cerebro. Por tanto, la caracterización de los mecanismos y de los principales sitios de acción de las poblaciones neuronales de la kisspeptina y su participación en la regulación de aspectos clave de la recrudescencia gonadal aún estaban incompletas. En contraposición a la administración sistémica, la administración intracerebroventricular (i.c.v.) evita el obstáculo que significa para los péptidos atravesar la barrera hematoencefálica y además evita el efecto directo sobre otros tejidos diana. Así, con el fin de analizar el efecto directo de las kisspeptinas de lubina, Kiss1 y Kiss2, sobre el cerebro, se realizaron inyecciones i.c.v. de los péptidos Kiss1-15 y Kiss2-12 en machos maduros. De esta forma se obtuvieron, por primera vez en peces teleósteos, evidencias funcionales de que las áreas neuroendocrinas del cerebro anterior y medio, el telencéfalo y el área preóptica, están implicadas en el control del eje reproductivo vía Kiss2/Gnrh1, modulando al eje reproductivo y en última instancia influyendo en la calidad del esperma.

En peces, al igual que en mamíferos, las acciones de las kisspeptinas sobre la liberación de gonadotrofinas se modulan a través de la activación de las neuronas Gnrh a nivel cerebral. Sin embargo, la presencia del sistema Kiss/Gpr54 en la hipófisis de varias especies de teleósteos sugería que este sistema puede ejercer una acción directa a nivel hipofisario. De hecho, el efecto directo de la kisspeptina sobre las células de la hipófisis se había evaluado en algunas especies de peces teleósteos mediante cultivos primarios. Sin embargo, los resultados obtenidos en estos trabajos eran en algunos casos contradictorios, haciendo necesario un estudio más profundo y detallado para intentar descifrar el papel del sistema Kiss/Gpr54 en el eje reproductivo, a nivel de la hipófisis. Para ello se analizó, por un lado, la naturaleza de las células Kiss2 en la hipófisis y, por otro, el efecto directo de los péptidos Kiss1-15 y Kiss2-12 sobre la liberación in vitro de las gonadotrofinas, Lh y Fsh, mediante cultivo de células dispersas de hipófisis de lubina. Este trabajo proporcionó evidencias funcionales y neuroanatómicas sobre el papel de Kiss2 en la modulación del eje reproductivo de esta especie de teleósteo marino, mediante su acción como hormona autocrina/paracrina, a nivel de la hipófisis. Estos resultados sugieren que el sistema Kiss/Gpr54 juega un papel destacado en el control del eje reproductivo de los peces teleósteos, no solo como neuropéptido hipofisiotrópico sino también como hormona autocrina/paracrina a nivel hipofisario.

Todavía se desconocen en gran medida las causas y los mecanismos que provocan la precocidad puberal en peces. Sin embargo, se sabe que la activación completa de la hipófisis, y consecuentemente de las gónadas, está mediada por una serie de eventos neuroendocrinos. Por tanto, el siguiente objetivo de esta Tesis Doctoral fue estudiar los eventos moleculares, neuroendocrinos, hormonales e histofisiológicos implicados en la pubertad de la lubina, con énfasis en el papel del sistema Kiss/Gpr54, dado la importancia del mismo encontrada en la pubertad de los mamíferos. Para ello se analizaron los efectos del tamaño corporal en el inicio de la pubertad, así como su relación con eventos fisiológicos relevantes inherentes a la primera gametogénesis de machos de lubina. Los resultados obtenidos en este estudio sugieren que el tamaño del pez es una condición permisiva para asegurar la completa efectividad de las acciones hormonales (hormona liberadora de las gonadotrofinas (Gnrh1), gonadotrofinas y andrógenos). Así, mientras que los peces pequeños (que mayoritariamente permanecieron inmaduros durante todo el ciclo reproductor) presentaron unos perfiles hormonales similares a los de los peces grandes (que mayoritariamente maduraron al final del ciclo reproductor) pero su magnitud fue mucho menor, siendo posiblemente ésta la razón por la cual el eje reproductivo no llegó a ser funcional. Además, este trabajo proporciona evidencias de la implicación de los sistemas kisspeptina y Gnrh1 en el inicio de la pubertad en machos de lubina. Así, es posible que kisspeptinas y Gnrh1 regulen la secreción de las gonadotrofinas y los andrógenos durante determinados periodos de desarrollo testicular.

Se sabe que las interacciones entre los sistemas Gnrh y melatoninérgico son las encargadas de mediar los efectos del fotoperíodo durante los eventos reproductivos en varias especies de peces teleósteos, incluida la lubina europea. En este sentido, el descubrimiento del sistema Kiss/Gpr54 en peces, podría proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos implicados en la regulación de la reproducción y de la pubertad de los mismos, incluido el fotoperíodico. Por tanto, durante esta Tesis se analizaron los perfiles de expresión génica de los sistemas Kiss y Gnrh cerebrales y su relación con las hormonas reproductivas en poblaciones de lubinas macho en las que se adelantó (expuestas a un fotoperiodo que adelanta la pubertad) o inhibió (expuestas a un fotoperiodo que inhibe la pubertad) la espermatogénesis. El objetivo fue determinar si el sistema kisspeptina actúa como un enlace mediador de la respuesta entre la señal lumínica ambiental y el eje reproductivo, haciendo patente la expresión diferencial de dicho sistema entre los mencionados tratamientos, al inicio de la gametogénesis. Los resultados revelan una fuerte correlación entre el control ambiental de la pubertad y los sistemas Kiss1 y Gnrh2 presentes en el cerebro anterior y medio. Así, la señalización fotoperiódica podría modular la actividad de las neuronas Kiss1 habenulares con el fin de controlar el inicio de la gametogénesis. Por otro lado, el fotoperíodo es capaz de alterar la fase y los niveles de los perfiles hormonales que, a su vez, estarían implicados en el inicio y la progresión de todo el proceso gametogénico. Más concretamente, la administración de los tratamientos fotoperiódicos es capaz de alterar los perfiles de Fsh y 11–KT en plasma desplazando o inhibiendo respectivamente el proceso espermatogénico.