Interacción entre el sistema endocrino y los osciladores circadianos en el carpín (Carassius auratus): regulación de genes reloj en relojes centrales y periféricos por péptidos de origen gastrointestinal y por glucocorticoides.

Resumen

Actualmente se considera el sistema circadiano de vertebrados como una red de osciladores comunicados entre sí. En el caso del carpín (Carassius auratus), no existe información sobre la localización anatómica de estos osciladores. Además, la comunicación entre ellos es uno de los temas más interesantes en cronobiología y en este sentido se ha descrito al hígado como un posible conector entre el metabolismo energético y el sistema circadiano. En el carpín, estudios previos demuestran la presencia en el hígado de la maquinaria molecular del reloj y su regulación por los ciclos luz/oscuridad e ingesta/ayuno.

Esta Tesis tiene por objetivo estudiar las vías de comunicación entre diferentes osciladores del carpín, con especial atención en el oscilador hepático como una de las conexiones del sistema circadiano con el metabolismo energético. Para ello, en primer lugar, se analizó la distribución anatómica de los diferentes osciladores endógenos, utilizando como indicador la presencia del gen reloj gper1b, clonado en esta Tesis; y su funcionalidad, entendida como la ritmicidad diaria de la expresión de este gen. Los resultados obtenidos permiten proponer que el sistema circadiano del carpín está formado por una red de osciladores en áreas centrales y periféricas que son funcionales y se encuentran en fase en condiciones de 12 h de luz y 12 h de oscuridad y alimentación fija con la acrofase anticipando la llegada del alimento y la luz, con diferentes amplitudes que sugieren una sensibilidad distinta a las señales.

Además, se analizaron dos señales candidatas a ser entradas del sistema circadiano: ghrelina y glucocorticoides. En el caso de la ghrelina, nuestro estudio anatómico, mediante inmunofluorescencia e hibridación in situ, muestra que tanto la ghrelina como el gen de su receptor ghs-r1a se expresan en multitud de áreas donde se detectó gper1b en el encéfalo y el tracto gastrointestinal, apoyando su posible papel como reguladora del sistema circadiano. Además, en el encéfalo se encuentran ambos (gh-r1a y gper1b) en localizaciones relacionadas con áreas fotosensibles y otras áreas asociadas con la regulación de la ingesta y el balance energético, demostrando la conexión anatómica entre la homeostasis energética y el sistema circadiano. Por otro lado, un análisis realizado mediante PCR cuantitativa mostro que existe un patrón de expresión rítmico diario de ghrelina y su receptor en hipotálamo y tracto gastrointestinal, con sus acrofases en fase con los genes per. Por su parte, los niveles plasmáticos de cortisol, medidos mediante ELISA, muestran un ritmo diario de concentración con su máximo antes del inicio de la fase activa apoyando un posible papel de “hormona del despertar”, como se ha descrito para otros vertebrados.

Finalmente, se analizó el impacto de ambas hormonas sobre la funcionalidad del oscilador hepático del carpín mediante estudios in vivo y cultivos organotípicos. Los resultados obtenidos muestran que, en carpines mantenidos en presencia de un ciclo luz/oscuridad y horario fijo de alimentación, éste es un oscilador funcional en fase con los demás, previamente estudiados por nuestro grupo de investigación. In vitro, el único gen que mantiene la ritmicidad diaria es gper1b que presenta una amplitud disminuida, lo que indica la necesidad de señales fisiológicas para su mantenimiento. Este oscilador, además, es sensible a la ghrelina y los glucocorticoides. En el caso de la ghrelina, en el hígado in vitro se induce la expresión de todos los genes reloj analizados a través de sus receptores y vía PLC-PKC y, parcialmente, AC-PKA. Los glucocorticoides inducen la expresión de los genes per, reprimen gbmal1a y gclock1a, y restablecen parcialmente la ritmicidad de todos los genes reloj analizados en hígado in vitro tras un tratamiento de 2 h con dexametasona, indicando su importancia como regulador del funcionamiento del oscilador hepático del carpín.

Los resultados obtenidos en la presente Tesis demuestran que el sistema circadiano del carpín está formado por osciladores localizados por todo el organismo que trabajan sincronizadamente y en fase, sin haberse localizado hasta ahora un oscilador maestro. Además, se muestra que el hígado en el carpín es sensible a señales procedentes de distintas áreas del organismo (incluyendo señales de estrés y de status energético) y se pone de manifiesto la relevancia de la comunicación entre el sistema endocrino y el sistema circadiano.

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