Implicación de la respuesta inmunitaria de la gónada de peces durante una infección con nodavirus y desarrollo de vacunas.

Yulema Valero Cuesta

Resumen


La dorada (Sparus aurata) y la lubina (Dicentrarchus labrax) son las especies de peces más importantes de la acuicultura Mediterránea y de España. Entre los principales problemas que impiden la mejora de su cultivo se encuentran las pérdidas económicas provocadas por patologías. Nodavirus (NNV), extendido por todo el mundo, incluido el Mediterráneo, produce elevadas mortalidades en lubina, sobre todo en larvas, mientras que infecta a doradas sin producir enfermedad. Además, NNV se transmite verticalmente y no existen métodos preventivos efectivos. Por ello, en esta Tesis Doctoral hemos estudiado la interacción entre la gónada de dorada/lubina y NNV y la respuesta inmunitaria desencadenada en cerebro y gónada de ambas especies (Parte 1ª con cuatro capítulos) y cómo prevenir la enfermedad en ejemplares mediante vacunación (Parte 2ª con 2 capítulos). Para ello, realizamos infecciones experimentales con NNV en lubinas y doradas observándose un 55% de mortalidad en la lubina y total resistencia en la dorada. Inicialmente, demostramos que NNV podía colonizar y replicar en el testículo de ambas especies detectándose RNA viral y rescatándose partículas infectivas mediante pases ciegos en líneas celulares en ambas especies. Además, se localizaron proteínas virales de la cápsida (CP y B2. Es más, NNV infectó células somáticas de ambas especies, aunque sólo células germinales de dorada. La infección con NNV alteró la síntesis y los niveles séricos de 17β-estradiol y 11-ketotestosterona así como la sensibilidad del cerebro y del testículo a estas hormonas, mientras que no hubo alteración de las funciones testiculares en ninguna especie según el índice gonadosomático, la morfología testicular y la expresión del gen dmrt1. Respecto a la respuesta inmunitaria, NNV desencadenó una alta respuesta inflamatoria en cerebro y gónada de lubina aunque en dorada dicha respuesta fue mucho menor. El interferón (IFN) es uno de los mecanismos antivirales más potentes. En esta Tesis hemos identificado varios genes de dorada y lubina que codifican moléculas implicadas en la ruta del IFN y evaluamos su expresión durante una infección con NNV en cerebro y gónada. En dorada, los genes identificados fueron mda5, tbk1, irf3, ifn, mx y pkr, cuya expresión se estimuló en cerebro pero no en gónada. Sin embargo, en lubina, además, también identificamos las secuencias génicas de lgp2, mavs, traf3, tank e irf7, siendo en la mayoría de ellos inhibida su expresión en cerebro pero estimulada en gónada. De una forma diferente a lo que ocurría con el IFN, la expresión de varios genes que codifican péptidos antimicrobianos (AMPs) se estimuló en el cerebro y gónada de lubina mientras que en dorada sólo se inhibió c3. Mediante una infección in vitro de gónada, pudimos determinar que, mientras algunos de los genes (hamp, dic y lyz) eran regulados localmente por la gónada otros (c3, bdef, pis) dependían más de la respuesta inmunitaria sistémica. Además de su función en la compactación del DNA durante la división celular, las histonas parecen poseen funciones antimicrobianas. Por ello, identificamos la secuencia completa de los genes que codifican las histonas H1 y H2B en lubina y dorada y estudiamos su expresión frente a NNV. Nuestros datos sugieren que la histona H1 puede tener un papel determinante en la respuesta inmunitaria contra NNV en el cerebro de las dos especies, mientras que la histona H2B parece ser más relevante en la respuesta inmunitaria de los leucocitos de riñón cefálico (HKLs). NNV es letal durante el desarrollo larvario, siendo estos estadios, además, muy difíciles de vacunar debido a que su sistema inmunitario es inmaduro y a su pequeño tamaño. Teniendo en cuenta la dificultad de aplicación de vacunas inyectables a peces pequeños, encapsulamos una vacuna de DNA contra NNV en nanopartículas de quitosano y la administramos oralmente a juveniles de lubina durante 2 días. A los 90 días no se detectaron anticuerpos específicos frente a NNV pero se observó un incremento de la citotoxicidad mediada por células (CMC) y la respuesta del IFN en el intestino posterior así como un retraso en el comienzo de la mortalidad y una supervivencia del 45% tras una infección experimental. Después, estudiamos la posibilidad de inducir la inmunidad pasiva de las larvas mediante la vacuna de DNA administrada a las hembras progenitoras. Así, la inyectamos intramuscularmente en hembras reproductoras de lubina observando transferencia materna de proteínas con función bactericida, pero no de sus mRNA, ya que en huevos recién fertilizados vacunados esta actividad aumentó. No obstante, la inmunización de hembras reproductoras estimuló una respuesta innata mayor y más temprana. En resumen, nuestro estudio demuestra por primera vez la localización de NNV en células de testículo en peces y cómo la infección afecta a las funciones inmuno- endocrinas y la sensibilidad de los tejidos infectados a hormonas sexuales. Finalmente, diseñamos una vacuna de DNA con resultados prometedores como herramienta preventiva contra NNV cuando se administra a juveniles o reproductores.

Enlace al documento completo:  http://hdl.handle.net/10201/50623


Palabras clave


Peces, Nodavirus, Respuesta inmunitaria, Gónada, Vacunas.

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Referencias


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